Амвросий Медиоланский родился около 340 года в Тревире (Трир) в знатной христианской семье.
Амвросий был первым латинским отцом церкви, который родился и вырос в христианской семье. Его аристократический род мог похвастаться мученицей Соферией, погибшей во время гонений при Диоклетиане. В молодости Амвросий получил блестящее риторское образование и был назначен на пост управляющего несколькими провинциями с резиденцией в Милане.
В 352 году, после смерти отца, Амвросий переселяется в Рим, где продолжает свое образование. Около 370 года он становится советником префекта, а через три года префектом Медиолана (Милан).
В 374 году умирает епископ города и возникает распря между арианами и православными города о кандидатуре нового предстоятеля. Согласно преданию, во время спора некий грудной младенец произнес «Амвросия во епископы!». Так или иначе, но его кандидатура была хорошим компромиссом. Сам префект хотел отказаться, но император Валентиниан утвердил выбор горожан.
Фактически за неделю с 30-го ноября до 7-го декабря Амвросий был крещен (по традиции того времени благочестивые верующие крестились довольно поздно), затем поставлен во чтеца, иподиакона, диакона, пресвитера и, наконец, епископа. После этого он раздал имущество и до конца жизни вел строгий образ жизни.
Будучи убежденным сторонником никейского православия, он противодействовал арианству и довольно быстро переубедил многих из своей паствы. Боролся он и с ее старыми языческими привычками. Когда Феодосий Великий при подавлении бунта в Фессалониках проявил излишнюю жесткость, Амвросий, по преданию, запретил ему приступать к Таинствам Церкви. Со свойственным ему уважению к церковной дисциплине император подчинился и покаялся.
Амвросий заслужил большую любовь паствы, сообщают даже о свершенных по его молитвам чудесам. Скончался он в мире со всеми 4-го апреля 397 года в Великую Субботу.